|
http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 774–778
CN 31-1300/Q |
|
Short Communication |
Expression and Purification of Recombinant SARS Coronavirus Spike Protein
YU Hao#, YANG Yong#, ZHANG Wei, XIE You-Hua1, QIN Jun1, WANG Yuan1, ZHENG Hua-Bao, ZHAO Guo-Ping, YANG Sheng*, JIANG Wei-Hong*
( Institute of Plant
Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the
Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 1Institute of Biochemistry
and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese
Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)
Abstract A novel coronavirus
(SARS-coronavirus, SARS-CoV) was discovered in association with cases of severe
acute respiratory syndrome (SARS) recently. The first step in coronavirus
infection is binding of the viral spike protein to certain receptor on host
cells. The spike protein is the main surface antigen of the coronavirus and
there should be antibodies against spike protein in patients’ serum. Thus, to
develop and expression protein fragment from spike protein gene are the
purposes of this experiment. Partial spike gene fragments (751～1925 bp, 2005～3410 bp, 1～1925
bp and 32～3659 bp) and its intact gene were
cloned into pET32 or pGEX vectors, and transformed into competent Escherichia
coli BL21(DE3) (pLysS), respectively. 63, 78, 98, 160 and 164 kD fusion
proteins were successfully expressed with amounts of 35%, 34%, 24%, 17% and 5%
of total cell protein. The soluble parts of the cell crude extract were then
partially purified by GST affinity chromatography.
Key
words severe acute
respiratory syndrome (SARS); coronavirus; spike protein; expression
________________________________________
Received:
May 29, 2003 Accepted:
June 17, 2003
This
work was supported by the grants from the Anti-SARS Foundation of the Chinese
Academy of Sciences and SIPPE Foundation
#These authors contributed
equally to this work
*Corresponding authors: Tel, 86-21-64042090-4720; Fax, 86-21-64042385; e-mail, [email protected] or [email protected]
重组SARS冠状病毒刺突蛋白的表达和分离纯化
俞浩# 杨勇# 张伟 谢幼华1 秦峻1 汪垣1 郑华宝 赵国屏 杨晟* 姜卫红*
( 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海200032; 1中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海200031 )
摘要 SARS冠状病毒的感染能引发人的严重急性呼吸综合征。 根据对其他种类冠状病毒的研究结果, 刺突(spike)蛋白(S蛋白)是病毒的主要表面抗原, 重组S蛋白可用于临床诊治, 疫苗制备和结构生物学研究。 SARS病毒S蛋白基因被分段和完整地克隆到不同的细菌表达载体进行了表达。 通过宿主菌的选择和条件的优化, 其中751～1925 bp、
2005～3410 bp、 1～1925
bp、 32～3659 bp片段及全长1～3768 bp DNA都在大肠杆菌中实现了高效表达, 表达量分别占菌体蛋白质的35%、 34%、
24%、 17%和5%, 并经亲和层析得到了部分纯化。
纯化后的蛋白质将用于诊断试剂和结构生物学研究。
关键词 严重急性呼吸综合症(SARS); 冠状病毒; 刺突蛋白;
表达
严重急性呼吸综合症(severe
acute respiratory syndrome, SARS)是新发现的传染病[1,2]。
研究表明一种以前未知的冠状病毒为导致该病的病原体[3～5]。 该种冠状病毒被命名为SARS冠状病毒,
其全基因组序列也很快被测定[6～8]。
通过对已知冠状病毒的基因组比较, SARS病毒的刺突蛋白(S蛋白)基因得到确认[6]。 S蛋白是冠状病毒表面最重要的膜蛋白。
它由两个结构域组成, 靠近N端的部分形成一个球形结构域, 靠近C端部分形成一个穿膜的棒状结构。 对已知的冠状病毒的研究已经证明, S蛋白和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关, 部分冠状病毒S蛋白前体在宿主的细胞质中合成以后会被切成两个部分S1和S2,
其中S1形成成熟蛋白质的球状部分, S2形成成熟蛋白质的棒状部分,
包括一个N螺旋, 一个M螺旋, 一个C螺旋和一个穿膜部分。 SARS 病毒S蛋白中经生物信息学分析找不到保守的碱性氨基酸剪切位点, 可能不剪切, 但是S1和S2相应结构应当存在[9]。
重组S蛋白可被用来作为抗原检测相应冠状病毒的感染[10,11], 并制备疫苗[12]。 因此, 高效表达和纯化重组SARS病毒S蛋白是诊治SARS的一个重要基础, 同时也是研究SARS病毒蛋白质结构的必需环节。本实验应用大肠杆菌高效表达了S蛋白, 并进行了分离纯化以供下一阶段深入研究。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 质粒、 菌株与培养基 大肠杆菌表达质粒pET-32系列购自Novagen公司,
pGEX系列购自Amersham Phamacia公司。 质粒pBluescript SK(大肠杆菌宿主细胞DH5α为本实验室保存。
BL21(DE3)(pLysS)购自Novagen公司。
培养E. coli时用LB培养基[10
g/L胰化蛋白胨(tryptone)、 5 g/L酵母提取物、
10 g/L NaCl, pH 7.0], 以表达蛋白质为目的时用2×YT培养基(16
g/L胰化蛋白胨、 10 g/L酵母提取物、 5 g/L NaCl, pH 7.0)。
1.1.2 试剂 PCR引物由博采合成; 限制性内切酶、
PyrobestTM DNA 聚合酶、 dNTP购自TaKaRa公司;
His单抗购自Novagen公司; 兔抗GST多克隆抗体为自制; 二抗购自Promega公司; Ni亲和层析树脂购自Qiagen公司; Glutathione Sepharose 4B 购自Amersham Pharmacia公司。 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 SARS病毒S蛋白基因的扩增 通过RT-PCR方法,
从感染SARS BJ01株的Vero E6细胞上清液中扩增得到SARS病毒的S蛋白基因,
克隆至pBluescript SK(经测序与已发表序列吻合(GenBank No：
AY278488[4]; 另文发表)。
1.2.2 质粒的构建 结合S蛋白的功能域预测结果,
利用pBS上的合适酶切位点直接或间接[以pBluescript
KS(1.2.3表达条件在检测目的基因是否表达时, 当含表达载体的菌体的A值为1时, 以0.8
mmol/L IPTG诱导, 28 ℃培养2 h, 离心收集细胞后,
悬浮在适量的PBS缓冲液, 并用Pressure
cell press 压榨或超声波破碎细胞。 细胞初提液通过SDS－PAGE及Gel
Scan 4.0软件扫描分析。
如无特别注明, 表达时用的培养基均为2×YT。
含表达载体pS1a, pS1b, pS2和pSΔ的菌体大量诱导时,
当菌体A值为1时,
以0.1 mmol/L IPTG诱导, 22 ℃培养4
h, 其余操作同上。
含pS质粒的菌体在培养时, 渗漏表达的产物具有一定的细胞毒性, 所以培养基中额外加入2％的葡萄糖, 当菌体生长到A值为2时,
以0.2 mmol/L IPTG诱导, 28 ℃培养2
h, 其余操作同上。
1.2.4 表达产物的纯化 表达产物的Ni柱亲和纯化根据Qiagen公司的蛋白质纯化手册操作; GST亲和纯化根据Amersham
Pharmacia GST Gene Fusion System (Third Edition, Revision 2) 的方法。
1.2.5 免疫印迹检测 根据Promega公司的《The
Source for Discovery》第三版中所提供的方法操作。
2 结果(Results)
2.1 表达载体的构建
S蛋白基因的PstI-SalI片段S1b(751～1925
bp)被克隆至pBluescript KS(+)的相应酶切位点中，然后将所得克隆的2 kb的BamHI-XhoI片段克隆至pET-32c得pS1b(图1); EcoRI-SalI片段S1a (1～1925
bp) 被克隆至pGEX-4T1的相应酶切位点得pS1a (图1); pBS的ScaI片段S2
(2005～3410 bp) 被克隆至pGEX-3x的SmaI酶切位点得pS2(图1);
pBS的 SpeI酶切片段SΔ
(32～3659 bp) 和pBluescript KS(+)连接，获得重组子，再将其3.7 kb的BamHI-NotI片段克隆至pGEX-4T2和pET-32a的相应酶切位点中(图1)。pBS的EcoRI-NotI被克隆至pET-32a的相应酶切位点得pFS32,
pFS32的3.8 kb的BamHI片段克隆至pGEX-4T1中的BamHI位点得pS,
pFS32的SalI-NotI酶切后，将1.8 kb的片段回收连接到pS1a的相应酶切位点中, 得
pSNS。
Fig.1 Schematic representation of S protein expression constructs
2.2 S蛋白及其片段的表达
SARS病毒的S蛋白基因被分段和完整地克隆到pET32和pGEX表达载体中进行融合表达。 通过宿主菌的选择和条件的优化, 其中751～1925 bp、
2005～3410 bp、
1～1925 bp、 32～3659
bp片段及全长1～3768 bp DNA都在大肠杆菌中实现了高效表达, 表达产物大小分别为： 63、
78、 98、 160和164
kD (图1、
图2和图3), 表达量分别占菌体蛋白质的35%、 34%、
24%、 17%和5%。
Fig.2 SDS-PAGE analysis of products of SARS-virus Spike protein fragment in E. coli BL21(DE3)(pLysS)
The induced condition was 0.1 mmol/L IPTG
for 3 h at 22 ℃,
cell sonicate was loaded onto a 10% SDS-PAGE. The arrows indicate the position of
expressed recombinant protein. 1, broad range protein marker (New England
Biolab #B7709S); 2. E. coli BL21(DE3)(pLysS) sonicate; 3, E. coli
BL21(DE3)(pLysS)/pS1b sonicate; 4, E. coli BL21(DE3)(pLysS)/pS2 sonicate; 5, E.
coli BL21(DE3)(pLysS)/pS1a sonicate; 6, E. coli BL21(DE3)(pLysS)/pSΔ
sonicate.
Fig.3 SDS-PAGE analysis of two different S protein expression constructs
The arrow indicates the position of expressed
recombinant protein. The induce condition was 0.1 mmol/L IPTG for 2 h at 28 ℃.
1, broad range protein marker (New England Biolab #B7709S); 2, E. coli
BL21(DE3)(pLysS) sonicate; 3, E. coli BL21(DE3)(pLysS)/pS sonicate; 4, E. coli
BL21(DE3)(pLysS)/pSNS sonicate.
2.3 表达条件对产物的影响
由于SΔ和S蛋白分子都很大,
因此我们对能否顺利表达及表达产物的可溶性程度不确定, 因此同时构建了几种表达载体。 实验证明,
不同的表达载体, 同一表达载体的不同构建, 目的蛋白质的表达效果有很大的不同。
在表达SΔ和S全长基因的融合蛋白质时,
pET32表达载体不能有效地表达目的蛋白质, 但我们可以用抗His的单抗检测到其表达(数据未提供), 而pGEX载体能表达出这两个蛋白质, 这可能与所利用的启动子不同有关。 pS和pSNS均能高效地表达S全长基因。 在以pS为表达质粒时,
由图4可见, 当培养基中额外加入2％的葡萄糖, 菌体生长到A值为2时,
以0.2 mmol/L IPTG诱导, 28 ℃培养2
h, 可溶性的目的蛋白质的比例最高。 虽然以0.1
mmol/L IPTG诱导, 22 ℃培养时, 可溶性的目的蛋白质的相对比例会更高, 但其表达出的总的目的蛋白质的量又太少 (未提供数据)。 另外, 我们在实验中发现,
诱导的时间太长, 目的蛋白质的产率反而会变小。 我们相信,
进一步的实验会发现更好的诱导条件的组合。 pSNS也能表达出S蛋白,
而且表达量比pS高(图4),
该结果也得到了多次重复, 但由于该融合蛋白质的C端比pS质粒表达出的要多出十几个氨基酸, 因此暂时没有对其作详细的研究。
2.4 表达产物的分离纯化与免疫印迹分析
含pS1a、 pS2和pS的表达细胞粗抽提液可溶性部分经GST亲和层析得到初步纯化[图5(A)], 并用Ni亲和柱纯化了S1b(未提供数据)。 S1a、
SΔ及S全长基因的融合蛋白质纯化后伴随着一条60 kD左右的条带。 起初我们推测该融合蛋白质发生了自发剪切, 但是Western印迹检测结果[图5(B)]表明60
kD的位置处没有有杂交信号, 因此, 可以排除该60
kD左右的蛋白质是因为有GST融合在上面而被亲和吸附下来的可能性。 我们不能确定该蛋白质是细胞内负责降解异源蛋白质的一类蛋白质(如DnaK),
还是另一类能与S蛋白相互作用的蛋白质。 蛋白质测序结果表明,
该蛋白质为热激蛋白HSP60, 有趣的是S2与GST的融合蛋白质过GST亲和柱后,
纯度却可达95％以上[图5(A)]。
Fig.4 SDS-PAGE analysis of products of GST-S fusion protein in E. coli BL21(DE3)(pLysS)
The arrow indicates the positions of
expressed recombinant proteins. Cells were cultured in 2×YT
medium and induced by IPTG for 2 h in 28 ℃.
1, broad range protein Marker (New England Biolab #B7709S); 2, supernatant of
BL21(DE3)(pLysS) sonicate; 3, supernatant of BL21(DE3)(pLysS)/pS sonicate, 0.2
mmol/L IPTG induction and 2% glucose as a medium supplement; 4, supernatant of
BL21(DE3)(pLysS)/pS sonicate, 0.4 mmol/L IPTG induction; 5, supernatant of
BL21(DE3)(pLysS)/pS sonicate, 0.7 mmol/L IPTG induction; 6, post-sonicate
pellet of BL21(DE3)(pLysS); 7, post-sonicate pellet of BL21(DE3)(pLysS)/pS, 0.2
mmol/L IPTG induction and 2% glucose as a medium supplement; 8, post-sonicate
pellet of BL21(DE3)(pLysS)/pS, 0.4 mmol/L IPTG induction; 9, post-sonicate
pellet of BL21(DE3)(pLysS)/pS, 0.7 mmol/L IPTG induction.
Fig.5 Analysis and identification of partially purified expression products
(A) SDS-PAGE analysis of partially
purified expression products of SARS spike protein. The arrows indicate the
recombinant protein bands. 1, broad range protein marker; 2, eluate from
glutathione-Sepharose 4B of cell extracts of E. coli BL21(DE3)(pLysS)/pS2; 3,
eluate from glutathione-Sepharose 4B of cell extracts of E. coli
BL21(DE3)(pLysS)/pS1a; 4, eluate from glutathione-Sepharose 4B of cell extracts
of E. coli BL21(DE3)(pLysS)/pS. (B) Western blot analysis of partially purified
S2, S1a and S GST fusion protein with anti-GST antibody (rabbit) and
anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate. The partially purified protein
were separated on a 10% SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane
and processed using anti-GST antibody, anti-rabbit IgG alkaline phosphatase
conjugate and BCIP/NBT enzyme substrate. 1, prestained protein marker (broad
range, New England Biolab #B7709S); 2, purified S2-GST fusion protein; 3,
partially purified S1a-GST fusion protein; 4, partially purified GST-S fusion
protein.
3讨论(Discussion)
芮伟等[9]预测SARS病毒S蛋白全长1256个氨基酸中,
1～13 aa是信号肽, 729～770、 879～1016、 1164～1185
aa处分别有一个螺旋区域, 提示可能为S2中的N/M/C
螺旋, 与病毒外壳膜和宿主细胞膜的融合有关。 1197～1218 aa有一段穿膜序列,
推测可能就是S蛋白和病毒外壳膜结合的位置。 N 螺旋之前预测可能有一个球状结构域, 提示可能为S蛋白的S1部分。 这些预测被我们用来作为S蛋白分段表达的理论依据。
我们表达的1～1925 bp片段对应的即是S1部分, 2005～3410
bp片段对应的是S2膜外片段。 而32～3659 bp则是去除了信号肽
(1～13 aa) 和病毒粒子内部分(1219～1256
aa) 的近全长片段, 因此我们命名为SΔ。
重组人冠状病毒229E和支气管炎冠状病毒的刺突蛋白都曾被表达, 用于检测相应的冠状病毒S蛋白特异性抗体[10,11]。
我们选取SARS病毒刺突蛋白基因的751～1925
bp片段即是对应于支气管炎冠状病毒刺突蛋白基因的 (1143～1665 bp), 为了确保覆盖和方便亚克隆,
则选取5′
端的PstI和3′ 端的SalI区域,
该片段命名为S1b。
实验结果表明,
上述S蛋白各个片段和全长均能在大肠杆菌以融合蛋白质的形式得到高效的表达。 有趣的是,
凡是有S蛋白N端的重组表达蛋白质,
亲和纯化后均伴有一60 kD的蛋白质, 而该蛋白质条带在菌体总蛋白质中并不明显, 在纯化过程中却得到了富集。 S1b的大小是63 kD左右,
所以我们尚不能确定纯化S1b时, 该蛋白质是否也被共纯化了。 看来要真正地纯化S蛋白,
还需借助于FPLC。
SΔ片段表达后的产物SΔ经中科院上海生化细胞所孙兵实验室检验, 可以和特异性抗体结合。 这从另一角度证明该片段确实有很好的免疫原性(另文发表)。
通过条件优化, 应该可以得到更高比例的可溶性蛋白质。 我们将根据后续工作的具体需要开展进一步的表达优化和分离纯化研究。
致谢： 感谢军事医学科学院为本研究提供BJ-01病毒株; 感谢上海生命科学研究院抗击SARS办公室的大力协助;
感谢生物信息中心李亦学研究员、 石铁流博士、 何有裕、 郝沛, 生化与细胞所屠强在生物信息学方面的帮助; 感谢生化与细胞所廖侃研究员、 李林研究员、 曾嵘副研究员和马衍青博士, 植物生理生态所陈晓亚研究员、
李启云、 倪张林、 董志诚等提供的帮助; 感谢本实验室王晶茹、
许祯、 陈茂林、 张燕、 王金刚、 田永强、 沈美娟的协助。
References
1 Poutanen SM, Low DE,
Henry B, Finkelstein S, Rose D, Green K, Tellier R et al. Identification of
severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med, www.nejm.org/March
31 2003/10.1056/NEMoa 030634
2 Lee N, Hui D, Wu A,
Chan P, Cameron P, Joynt GM, Ahuja A et al. A major outbreak of severe acute respiratory syndrome in
Hong Kong. N Engl J Med, www.nejm.org/April 7 2003/10.1056/NEJMoa 030685
3 Peiris JSM, Lai ST,
Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, Nicholls J et al. Coronavirus as a possible
cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361: 1319－1325
4 Ksiazek TG, Erdman D,
Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, Tong S et al. A novel coronavirus
associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med,
www.nejm.org/April 10 2003/10.1056/NEJMoa 020781
5 Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt
HR, Becker S, Rabenau H et al. Identification of a novel coronavirus in
patients with severe acute respiratory syndrome. N Eng J Med,
www.nejm.org/April 10 2003/10.1056/NEJMoa 030747
6 Rota PA, Oberste MS,
Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Penaranda S et al.
Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute
respiratory syndrome. Science, 2003, 300(5624): 1394－1399
7 Marra MA, Jones SJM,
Astell CR, Holt RA, Brooks-Wilson A, Butterfield YSN, Khattra J et al. The
genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science, 2003, 300(5624):
1399－1404
8 Qin ED, Zhu QY, Yu M,
Fan BC, Chang GH, Si BY, Yang BA et al. A complete sequence and comparative
analysis of strain (BJ01) of the SARS-associated virus. Chinese Sci Bull, 2003,
48(10): 941－948
9 Rui W, Zhang QP, Shi L,
Lu M. Recent trends in research of SARS coronavirus genome, protein and course
of invasion into host cell. Chinese Med J, 2003, in press
(引自： 中华医学杂志)
10 Pohl-Koppe A, Raabe T,
Siddell SG, Ter MV. Detection of human coronavirus 229E-specific antibodies
using recombinant fusion proteins. J Virol Methods, 1995, 55: 175－183
11 Wang CH, Hong CC, Seak JCH.
An ELISA for antibodies against infectious bronchitis virus using and S1 spike
polypeptide. Vet Microbiol, 2002, 85: 333－342
12 Streatfield SJ, Jilka JM, Hood EE, Turner DD, Bailey MR, Mayor JM, Woodard SL et al. Plant-based vaccines: Unique advantages. Vaccine, 2001, 19(17-19): 2742－2748